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案例一 基因组规模的 CRISPR-Cas9 敲除和转录激活筛选

Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening

文章杂志：Nature Protocols
影响因子：14.8
文章单位：Protocols
发表年份：2017年

一、研究背景

早期的基因筛选方法依赖于化学 DNA 诱变剂来诱导遗传变化，但此过程效率低下，突变识别成本高昂。使用 RNA 干扰技术扰乱转录水平的筛选方法促成许多生物学研究进展，但这种方法可能受到转录物的不完全敲除和高脱靶活性的阻碍。目前，CRISPR/Cas9 技术通过将 Cas9 蛋白与汇集的 sgRNA 文库组合用于基因组规模筛选。本研究描述了使用 CRISPR-Cas9 技术进行基因组规模敲除和转录激活筛选的方案。

二、技术路线

  • 19,050个人类或20,611个小鼠编码基因
    ，每个基因6个sgRNA

    构建GeCKO文库

    靶点深度测序及分析

    候选基因验证

    12,430个人类或23,439小鼠，
    每个基因3个sgRNA

    构建SAM文库

    靶点深度测序及分析

    候选基因验证

  • 1. 文库设计

    （1）根据已知的 sgRNA 靶向规则，识别出 sgRNA 文库中感兴趣的基因组区域。
    （2）sgRNA 选择：最小 Off-target；最大 on-target；GC 含量；避免均聚物延伸。

  • 2. CRISPR 敲除文库（GeCKO）及转录激活文库（SAM）

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  • 3. 测序，分析方法

    用 NextSeq 或 HiSeq 进行测序，本文使用 RIGER 分析，文库中每个 sgRNA 的读取量大于100 reads 的覆盖率；分析方法有 RIGER、RSA、MAGeck 和 STARS。

  • 4. 候选基因验证

    （1）表型验证：扩增候选基因上的靶点序列，进行 NGS 测序并统计 Indel 频率。
    （2）蛋白表达验证：western blot 或者免疫组化。     placeholder+image

四、研究结论

该研究提供了确定筛选参数和保持足够覆盖率的指南。为了验证筛选到的候选基因，研究者进一步描述了通过分析 indel 率和转录激活来确定筛选表型以及遗传扰动的策略。

案例二 用于人类细胞功能基因组学的 CRISPR/Cas9 文库的高通量筛选

High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells

文章杂志：Nature
影响因子：64.8
文章单位：北京大学生命科学学院
发表年份：2014年

一、研究背景

近几年来，基因编辑大大改变了科研人员在哺乳动物系统中研究基因及其功能的方式。CRISPR/Cas 系统最初被发现是细菌和古细菌为抵御病毒和质粒不断攻击而演化来的一种获得性免疫防御机制。在 II 型 CRISPR/Cas 系统中、Cas9 内切酶家族在单导向 RNA （single-guide RNA，生成 DNA 双链断裂（DSBs），sgRNA）引导下靶向和剪切外源基因。该研究利用这种有效的基因编辑技术和简单的程序可编程性，开发了一种利用基于功能的基因筛选来实现基因鉴定的方法。

二、技术路线

文库构建
筛选及检测
数据分析

291个靶基因， sgRNA 文库慢病毒感染，利用Golden Gate构建sgRNA慢病毒载体，大多数基因设计3个gRNA。

筛选处理后的细胞， PCR 扩增 sgRNA，
HiSeq 2500高通量测序

sgRNA 富集统计
靶基因的富集
候选基因验证

三、研究结果

1. 筛选 PA/LFnDTA 和白喉毒素（DT）毒性的必要基因

高通量测序在对照组中检测到863种（占总量99.3％）sgRNAs，sgRNA 的组成和读数显示在两种不同筛选之间存在明显差异，大多数 sgRNA 在两种情况下都被消耗，在三轮毒素处理后。研究者选择了靶向 PA/LFnDTA 筛选的19个基因的21个 sgRNA 和靶向白喉毒素筛选的15个基因的 15个 sgRNAs 作为研究的潜在候选者，从 PA/LFnDTA 和白喉毒素筛选中分别筛选出炭疽毒素受体基因 ANTXR1 和白喉毒素受体基因 HBEGF。

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2. 候选基因的遗传验证

研究者使用 XTT 细胞活力和 LDH 细胞死亡试验，检测了所有三个突变体克隆对这两种毒素的敏感性，HeLa ANTXR-/- 和 HeLa HBEGF-/- 对 PA 和白喉毒素介导的毒性产生了完全的抗性。
为确定本研究的筛选是否揭示了与两种毒素中毒机制有关的新基因，选择了富集程度较多的基因并测试了它们产生耐氧表型的能力，PLXNA1、 FZD10、PECR 和 CD81 被证实是参与 PA 介导的炭疽毒性的潜在功能候选基因。而且作者选择了 PECR 基因进行进一步的广泛研究，在 HeLa 细胞获得的两个独立克隆中，PECR 的完全丧失增加了对 PA/LFnDTA 的抗性水平，但对白喉毒素没有影响。

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四、研究结论

本研究利用文库功能筛查结合高通量测序分析。并在随后的细胞实验中对这些候选基因进行了进 一步的功能验证，成功地鉴别出了对于炭疽和白喉毒素毒性至关重要的宿主基因。这种强大的基因筛选策略的广泛应用。不仅会促进细菌毒素重要基因的快速鉴定，而且还能发现参与其他生物过程的基因。

参考文献

[1] Joung J, Konermann S, Gootenberg J S, et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening[J]. Nature Protocols, 2017, 12(4):828-863.
[2] Zhou Y, Zhu S, Cai C, et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells[J]. Nature, 2014, 509(2):487-491.

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